荧光定量PCR引物探针设计如何下手？全是干货

浩瀚无穷

分子实验千千万，PCR就是这第一道坎。
同样的体系，同样的程序，同样的操作，一路战战兢兢，也有可能在意想不到并且微不足道的地方翻车。
因此，我们要注重实验过程中的每一个步骤和细节。
引物和探针是影响荧光定量 PCR成功与否以及其结果是否可靠的关键因素之一，引物和探针的设计也是荧光定量PCR实验必须要掌握的技能之一。
荧光定量PCR引物设计的基本原则[1,2,3]：
荧光定量PCR所用的引物与普通PCR的引物，在引物设计上所要求的参数有所不同。

• 引物长度
  一般为15~30 bp，最好是18~24 bp，引物过短会降低扩增特异性，引物过长会导致杂交速率降低，上下游引物长度相差最好不超过4 bp。
  
• 引物Tm值
  荧光定量PCR引物的Tm一般介于59~68 °C之间，要高于普通PCR的引物，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。最佳的退火温度为 59 °C 或 60 °C，退火温度过高，引物与模板结合不牢固导致扩增效率降低，退火温度过低，容易发生错配产生非特异性扩增。
  
• 引物GC含量
  引物GC含量在 40%~60% 之间，上下游引物的GC含量不能相差太大。
  引物5'端和中间序列的△G值应该相对较高，以增加稳定性，而3′ 端△G值较低。一对引物的GC含量和Tm值应该协调。
  
• 扩增产物的长度
  荧光定量PCR扩增产物长度在80~150 bp之间，一般不超过300 bp。
  
• 引物尽量跨越内含子
  跨较大内含子设计引物可以有效地消除基因组DNA污染的影响。
  
• 引物碱基要随机分布
  引物中ATGC碱基最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在，末端最好是G或C。
  
• 扩增产物不能形成二级结构
  扩增产物不能形成二级结构，选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。
  
• 引物自身及引物之间不应存在互补序[4]
  引物自身不能有超过4个连续互补的碱基，引物自身存在互补序列会折叠成发夹结构，使引物本身复性形成空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
  引物之间不能有超过4个连续互补的碱基，避免引物内部出现二级结构，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体的形成。
  
• 引物5′端可以修饰
  引物的5′端决定着PCR产物的长度，可以被修饰而不影响扩增的特异性。
  引物5′端修饰包括：添加酶切位点；标记生物素、荧光物质、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列、起始密码子、终止密码子等。
  
• 引物要具有特异性
  引物设计完成以后，应对其进行 BLAST 检测，引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
  
• 引物3′端
  引物3′端末位碱基尽量不要选择A。因为末位为A时，在错配的情况下易合成引发链，可以选择G和C。
  

TaqMan 探针设计的基本原则 [5,6,7]：

• 探针的长度和位置
  探针的长度最好在25~32 bp之间，探针应靠近上游引物，上游引物的3'端与探针的5'端之间距离为1~20 bp，最佳是1 bp，确保在PCR扩增时第一时间将探针水解释放荧光信号。
  
• 探针的Tm值和GC含量
  探针的Tm值在67~72℃之间，要比引物的Tm值高8~10℃，保证在退火时探针先于引物与目的片段结合。探针最好是富含GC的保守片段，确保其的Tm值较高。
  
• 扩增产物不能形成二级结构
  探针尽量避免出现二聚体或者高级结构，以保证探针与模板的结合效率。
  
• 引物的5'端避免G
  荧光探针法中的引物5'端避免使用G，因为单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号。
  
• 探针的碱基分布
  探针中要避免多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个及以上的G碱基连续。探针中碱基C的含量要明显高于G的含量，因为较多的G会产生高级结构。
  

TaqMan探针的荧光基团和淬灭基团选择

• 根据荧光定量PCR仪的通道选择适配的荧光基团，优先选择常用的荧光基团。
  
• 根据已选的荧光基团种类搭配相应的淬灭基团。
  

荧光探针常用的淬灭基团有TAMRA、Eclipse及BHQ系列。

• TAMRA：淬灭范围为520 nm-600 nm
  TAMRA是最早使用的荧光染料，自身存在荧光背景，增加对荧光信号采集的干扰。TAMRA的吸收光谱范围较窄，可与之匹配的报告基团种类比较少。
  
• Eclipse：淬灭范围为390 nm-625 nm
  Eclipse为非荧光染料，其本身不产生荧光，检测灵敏度更高。Eclipse具有较宽的吸光范围，可淬灭的报告基团种类很多，如FAM、HEX、TAMRA、ROX等，适用于多重qPCR反应。
  
• BHQ系列：淬灭范围为430 nm-近红外
  BHQ系列为非荧光染料，本身不产生荧光，并且能够全部吸收一定范围内报告基团发出的荧光信号，极大地降低了荧光本底信号。BHQ系列包括BHQ-0（430 nm-520 nm）、BHQ-1（480 nm-580 nm）、BHQ-2（550 nm-650 nm）、BHQ-3（620 nm-730 nm）。
  组合使用的BHQ系列染料的吸收光谱覆盖范围则更广，可淬灭的报告基团种类更多，包括Cy3、Cy5等，适用于多重qPCR。
  

由于TaqMan探针的Tm值要求较高，因此TaqMan探针的长度相对较长，设计的难度增加，合成的成本较高。
在TaqMan探针的基础上标记一个MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可使探针的Tm值提高10℃左右。TaqMan MGB探针的长度更短(14~20 bp)，更容易在模板上找到保守区域进行设计，特异性更强，适用于SNP分型检测。
TaqMan MGB探针是双标记探针，MGB连接一个不发荧光的淬灭基团Eclipse，荧光本底信号低，检测灵敏度高。
<hr/>引物的纯化
目前主流的纯化方式有：OPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化，这三种方式技术相对成熟，价格低。

• OPC纯化：
  使用反相层析柱对DNA片段进行纯化，可将合成失败的不完整DNA片段去除，适用于40 mer以下引物的纯化。
  得到的DNA纯度通常在85%~95%，可以用于普通PCR、测序等。
  
• PAGE纯化：
  使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对DNA片段进行分离纯化，基于尺寸和构象分离全长产物和失败序列，可以分离相差一个碱基的引物(120 bp以内)。
  得到的引物可以用于普通PCR、测序、荧光定量PCR、定点突变、RNA干扰等，荧光定量PCR的引物至少要达到PAGE级。
  
• HPLC纯化：
  使用高效液相色谱原理，依据DNA的疏水性对DNA片段进行分离纯化，可以有效的去除失败序列或未结合的标记物，同时配合质谱对DNA进行定性分析，以保证回收片段的正确性。一般来说较长的片段具有较强的疏水性，AT含量高的片段也具有较强的疏水性。
  得到的DNA纯度大于95%，主要用于修饰引物的纯化、基因重组、定点突变等要求较高的基因工程实验，荧光定量PCR的探针纯化要达到HPLC级。
  

引物修饰后，产量要比一般引物低，主要因为是修饰单体稳定性较差，偶联时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常采用HPLC纯化，纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以修饰引物的价格要更高。
引物的溶解
合成的引物以干粉形式运输，开盖前先离心将引物粉末收集到管底。一般建议用RNase-free的TE (pH 8.0) Buffer溶解引物，最好不要用蒸馏水溶解引物，因为蒸馏水的pH值偏低（pH 4~5），导致引物容易降解。
引物的浓度 [8]
一般合成2 OD引物，可以做200~500次50 ul标准PCR反应。引物在高浓度的状况下保存比较稳定，因此建议将引物的浓度配制成100 μM的储备液保存，使用时再稀释为10 μM的工作液。
PCR体系中引物浓度会影响扩增的特异性，引物最终浓度最佳范围为0.1~0.5 μM，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，并且增加引物之间形成二聚体的机会。
引物的保存方法
引物的稳定性依赖于储存条件。引物在干粉状态下可以在-20℃保存1年以上，溶解的引物以高浓度储存在-20℃，可以稳定保存6个月。如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。
荧光探针的保存方法
荧光探针必须避光保存，干粉可于-80℃保存一年以上。通常将探针配制成100 μM的储备液，分装成几份 (每份最多反复冻融5次)，于-20℃保存。使用前，将配制好的储备液稀释成工作液 (10 μM)，剩余部分于-20℃保存。
引物设计原则条条框框，高分引物何处寻？
下期将揭晓常用引物设计软件的具体操作细则。
参考文献：

• Thornton B, Basu C. Rapid and simple method of qPCR primer design. Methods Mol Biol. 2015; 1275: 173-9. Doi: 10.1007/978-1-4939-2365-6_13.
  
• Bustin S, Huggett J. qPCR primer design revisited. Biomol Detect Quantif. 2017; 14: 19-28. Doi: 10.1016/j.bdq.2017.11.001.
  
• Bustin SA, Mueller R, Nolan T. Parameters for Successful PCR Primer Design. Methods Mol Biol. 2020; 2065: 5-22. Doi: 10.1007/978-1-4939-9833-3_2.
  
• Garafutdinov RR, Galimova AA, Sakhabutdinova AR. The influence of quality of primers on the formation of primer dimers in PCR. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2020; 39(9): 1251-1269. Doi: 10.1080/15257770.2020.1803354.
  
• Proudnikov D, Yuferov V, Zhou Y, LaForge KS, Ho A, Kreek MJ. Optimizing primer-probe design for fluorescent PCR. J Neurosci Methods. 2003; 123(1): 31-45. Doi: 10.1016/s0165-0270(02)00325-4.
  
• Ryazantsev DY, Tsybulsky DA, Prokhorenko IA, Kvach MV, Martynenko YV, Philipchenko PM, Shmanai VV, Korshun VA, Zavriev SK. Two-dye and one- or two-quencher DNA probes for real-time PCR assay: synthesis and comparison with a TaqMan™ probe. Anal Bioanal Chem. 2012; 404(1): 59-68. Doi: 10.1007/s00216-012-6114-4.
  
• Rodríguez A, Rodríguez M, Córdoba JJ, Andrade MJ. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 2015; 1275: 31-56. Doi: 10.1007/978-1-4939-2365-6_3.
  
• Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009; 55(4): 611-22. Doi: 10.1373/clinchem.2008.112797.
  

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