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PCR发展历程
1、相关概念及原理
1.1 相关概念
PCR：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物,以目的基因为模板进行的 DNA体外扩增反应，类似于DNA的天然复制过程。反应产物随循环数的增加成指数扩增，可高效获取大量目的基因。
荧光定量PCR：荧光实时定量PCR是通过对扩增反应中每一个循环产物的荧光信号进行实时监测，并分析指数期的扩增情况来实现对起始模板的定量分析。该技术所使用的的荧光来源包括荧光探针和荧光染料。前者是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，因此特异性更高；而后者则能结合所有的双链DNA，因此不必因模板的不同而特别定制，通用性强，但需要保证扩增产物的特异性。
扩增曲线：以循环数为横坐标，以产生的荧光信号强度为纵坐标绘制而成。扩增曲线可分成背景信号阶段、信号指数扩增阶段和平台期三个阶段。只有在指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系。扩增曲线如下图：
指数扩增三个阶段
扩增曲线
基线：仪器软件通常将基线设为3～15循环时的荧光信号，也可手动调整，一般不需调整。
荧光阈值：是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，一般缺省设置为3~15个循环荧光信号的标准偏差的10倍，实质是一个人为设定的荧光信号强度标准，高于阈值的荧光信号可认为是真实信号。
循环阈值（CT值）：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为CT值(C代表cycle,T代表Threshold)，实质就是达到人为设定的荧光信号强度标准需要经历的循环数。
标准曲线：以CT值为纵坐标，以梯度稀释的标准品浓度对数为横坐标，得到的曲线。标准曲线的R^2即决定系数要求大于0.98，或者R即相关系数大于0.99，扩增效率E在90%~110%之间。
标准曲线的计算公式为CT=-kLogX+b，CT为循环数，k为标准曲线的斜率，X为标准品的稀释后的拷贝数，b为y轴上的截距，将系列稀释的标准品拷贝数和CT值带入公式，可得到斜率k和截距b。
标准曲线的扩增效率E=[10^(-1/k)]-1
样本拷贝数计算公式为X=10^[(CT-b)/k]，即将得到的样本CT值带入标准曲线公式，推导X值。
标准曲线
扩增曲线中的概念展示
1.2 荧光定量原理
1.2.1 PCR扩增的理论模式
扩增产物的总数量用上述公式表示（公式基于PCR指数扩增的原理），公式中Y为PCR产物的分子数量，X为原始模板的数量，n为循环周期数，E为扩增效率,位于0至1之间。此公式仅在限定的扩增周期数即指数扩增期(通常为20～30个循环)内成立，超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增，此时E逐步降低直至0。重点：根据公式可知，差一个循环数，样本浓度倍数相差两倍；差两个循环数，浓度相差四倍。
因此只有在PCR的指数扩增期的扩增产物量才与起始模板的量有正比例相关。定量PCR 必须在PCR扩增的指数期进行测定，而以前的非实时PCR方法很难确定特定的PCR的扩增指数期。实时PCR的出现,则使得整个PCR的扩增过程测定信号的变化处于动态监测之中，很容易判断指数扩增期的出现。
1.2.2 实时荧光PCR的理论基础
目前的实时荧光 PCR无一例外的均是基于荧光共振能量转移( fluorescence resonanceenergy transfer,FRET)的原理。也就是说,当一个荧光基团与一个荧光淬灭基团(可以淬灭前者的发射光谱)距离邻近至一定范围时，就会发生荧光能量转移，淬灭基团会吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分开,淬灭作用即消失。因此，可以利用 FRET，选择合适的荧光基团和淬灭基团对对核酸探针或引物进行标记，再利用核酸杂交和核酸水解所致荧光基团和淬灭基团结合或分开的原理，建立各种实时荧光PCR方法。
2、荧光定量PCR的种类
2.1 TaqMan实时荧光PCR的基本原理
以TaqMan荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术，在目前国内的临床诊断中应用最为广泛。研究发现，发现热稳定DNA聚合酶Taq在具有5'→3'方向的聚合酶活性的同时，还具有对聚合延伸过程中遇到的与靶序列结合的核苷酸序列的5'→3核酸外切酶活性。于是在PCR过程中，TaqDNA聚合酶可利用其5′核酸外切酶活性切割与靶序列结合的寡核苷酸探针。利用TaqDNA 聚合酶的这一特性,可以检测靶序列的扩增。需要注意探针的3'末端设计为不能延伸以防其成为PCR扩增的引物。扩增中，当引物通过TaqDNA 聚合酶的聚合反应延伸至接近已与靶核酸序列结合的探针时，TaqDNA聚合酶的5'→3'外切酶活性即能将探针降解成小片段，探针降解的越多，扩增的产物也越多，从而指示靶核酸的存在及量。
在TaqMan探针的基础上,进一步发展了MGB探针(minor groove binding probe,MGB probe)。在它的3'端连接的不是通常的 TAMRA淬灭基因，而是一种非荧光淬灭剂(nonfluorescence quencher,NFQ)，其3'端还有一种小沟结合分子，即 MGB探针。MGB结合在探针与靶基因杂交形成双螺旋的小沟( minor groove)中，该分子可大大提高退火温度，因此特异性更强。
TaqMan作用过程
2.2 双杂交探针实时荧光 PCR的基本原理
双杂交探针(dual hybridization probe)实时荧光PCR就是在两条寡核苷酸杂交探针上分别标记荧光供体基团和荧光受体基团，两基团的激发光光谱有一定程度的重叠。对两条探针的要求是,其与靶核酸的杂交位置应相互邻近。过程：当两条探针与靶基因同时杂交时，两个探针以一头一尾方式杂交于靶序列，这样两个荧光基团靠得很近，其间的距离在1～10nm（通常为1～5个碱基)，依据FRET原理,，在供体基团一定波长的激发光作用下，发生能量传递，从而激发受体基团发射另一种荧光。
双杂交探针作用过程
2.3 分子信标实时荧光PCR的基本原理
分子信标(molecular beacon，MB)探针由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链 DNA分子组成，在反应溶液中，它们呈发夹型或茎环结构，这样荧光染料和淬灭基团距离很近而发生FRET。分子信标的环部分和靶核酸互补，而探针的两头由于互补而成为茎。当分子信标为茎环结构时，淬灭基团和荧光基团距离很近，报告基团的荧光信号被淬灭基团吸收，从而抑制报告基团产生荧光。分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而测定的特异要好于线性探针。分子信标探针可用于鉴定点突变。
分子信标作用过程
2.4 双链DNA交联荧光染料实时荧光PCR的基本原理
SYBR Green是一种可以非特异的结合双链DNA(dsDNA)小沟的荧光染料，它嵌合进DNA双链，但不结合单链。当SYBR Green 在溶液中而未结合dsDNA时，仅产生很少的荧光，当它结合dsDNA时，就发射出很强的荧光信号。在PCR反应体系中，加入过量SYBR green荧光染料，在 PCR扩增过程中，进行DNA 聚合反应时,由于双链DNA的增加，荧光信号也增加，当 DNA变性时，则荧光信号降低。因此在每个PCR循环结束时检测荧光强度的变化,就可知道DNA 增加的量。由于任何引物对扩增的产物都可用SYBR Green 检测。优点：能监测任何双链 DNA序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。缺点：由于荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的双链如引物二聚体和非特异性扩增产物等结合，使实验产生假阳性信号。引物二聚体和非特异性扩增产物等所致非特异荧光信号的问题目前可以用带有熔解曲线( melting curve）分析的软件加以解决，特异性好的引物熔解曲线在80℃后只有一个主峰，小于80℃如有峰，可能是引物二聚体或短的非特异性扩增产物，可通过无模板对照确定是否为引物二聚体。
SYBR Green作用过程
熔解曲线单峰
2.5 多重实时荧光PCR
多重实时PCR指在一个PCR管中用多个荧光探针来区分多个扩增子。其优点是：
①可在一个反应管中，同时检测多个靶核酸，提高检测效率;
②如果将多重PCR扩增的靶核酸之一设为内质控(internal control,IC) ，则可为实时荧光PCR 检测提供假阴性的内部质控，以判断检测有阴性结果的有效性。
除探针法外，染料法也可通过结合熔解曲线实现多重PCR。
3 荧光PCR的特点
3.1 实时监控
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，实现对整个PCR进程的实时监测。此外，实时荧光PCR采用闭管分析，无须电泳等PCR后处理步骤，有效消除核酸的交叉污染。
3.2 特异性强
由于在PCR反应体系中加入荧光探针，使得非特异性产物不能与探针杂交，尤其对与特异性产物分子量接近、通过电泳无法分开的产物更为有效，而且分子信标、杂交探针和新型的探针可检测出靶序列中单个碱基的错配缺失或插入突变。
3.3 准确定量
由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。而实时荧光PCR方法通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线计算样本浓度。 |
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发表于 2022-11-30 16:56:18